Практикум по биохимии, изд. 2
Автор(ы): | Северин С. Е. и др.
06.10.2007
|
Год изд.: | 1989 |
Издание: | 2 |
Описание: | В пособии рассматриваются современные методы аналитической биохимии, основы препаративной энзимологии, методы изучения кинетики и механизмов регуляции ферментативных процессов, приемы иммобилизации ферментов и иммуноферментного анализа, а также методы, используемые при изучении метаболизма митохондрий и бионергетики. |
Оглавление: |
Обложка книги.
Предисловие [3]Список сокращений [4] РАЗДЕЛ ПЕРВЫЙ Углеводы и липиды (Г. А. Соловьёва, Н. Н. Зайцева, В. И. Телепнева) I. Методы концентрационного анализа [5] 1. Фотометрические (спектрофотометрический и колориметрический) методы [5] 2. Манометрический метод Варбурга [10] II. Количественное определение углеводов и продуктов их обмена [18] 1. Определение глюкозы энзиматическим методом [18] Определение глюкозы в крови [19] Определение активности глюкозо-оксидазы (манометрический метод) [20] 2. Определение глюкозы феррицианидным методом [21] 3. Определение глюкозы и гликогена с антроном [23] 4. Определение гликогена после ферментативного гидролиза глюкоамилазой из Aspergillus niger [25] 5. Выделение гликогена из биологического материала [25] 6. Методы определения молочной кислоты [26] Колориметрический метод с n-оксидифенилом [26] Энзиматический метод [27] 7. Методы определения пировиноградной кислоты [29] Манометрический метод с использованием пируватдекарбоксилазы [29] Энзиматический метод с использованием лактатдегидрогеназы [31] Спектрофотометрическое определение с семикарбазидом [32] 8. Определение неорганического фосфата [33] Метод Фиске—Суббароу [34] Метод Херса [35] Метод Самнера [35] Метод Ратбуна и Ветлах [36] Метод Бенцини [37] 9. Определение лабильных фосфорных соединений [37] 10. Определение фосфотриоз (глицеральдегид-3-фосфата и диоксиацетонфосфата) [38] 11. Определение глюкозо-1-фосфата (легкогидролизуемых в кислотах фосфорных соединений) [39] 12. Определение глюкозо-6-фосфата [40] Определение по фосфату [40] Энзиматический метод [40] 13. Определение фруктозо-1,6-дифосфата [41] Определение по фруктозе [41] Анализ чистоты бариевой соли фруктозо-1,6-дифосфата [43] Перевод бариевой соли фруктозо-1,6-дифосфата в натриевую [43] 14. Определение фруктозо-6-фосфата [44] 15. Определение общего фосфора [44] 16. Количественное определение фосфорных эфиров углеводов после разделения методом бумажной хроматографии [45] III. Ферментативные превращения углеводов [48] 1. Анаэробный распад углеводов [49] Анаэробный распад гликогена (гликогенолиз) [50] Анаэробный распад глюкозы (гликолиз) [51] Гликолиз в присутствии йодацетата [52] Гликолиз в присутствии фторида [53] Влияние фторида на превращение фруктозо-1,6-дифосфата в молочную кислоту [54] Влияние кофакторов на превращение фруктозо-1,6-дифосфата в присутствии фторида [55] Влияние кислорода на процесс гликолиза (эффект Пастера) [56] 2. Превращения промежуточных продуктов гликолиза [58 Превращение глюкозо-1-фосфата в гликоген [58] Влияние адреналина на уровень сахара крови и активность фосфорилазы мышечной ткани [59] Превращение глюкозо-1-фосфата в глюкозо-6-фосфат [60] Превращение глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат [61] Превращение фруктозо-6-фосфата в глюкозо-6-фосфат [63] Образование фосфотриоз из фруктозо-1,6-дифосфата [63] 3. Фосфатазное расщепление гексозофосфатов [65] Превращение глюкозо-6-фосфата в глюкозу [65] Превращение фрук-тозо-1,6-дифосфата во фруктозо-6-фосфат [66] IV. Методы выделения, фракционирования и количественного определения липидов [67] 1. Основные приемы работы с липидами [67] 2. Определение общего содержания липидов в тканях [70] 3. Определение липидов мозговой ткани с помощью хроматографии в тонком слое [71] 4. Выделение триацилглицеринов из печени крысы [75] 5. Выделение фосфолипидов из яичных желтков [76] РАЗДЕЛ ВТОРОЙ Природные азотсодержащие соединения (М. И. Сафронова, Н. Б. Гусев, Л. Н. Матвеева, М. М. Фейгина) А. Белки [80] I. Методы количественного определения белка в биологическом материале [80] 1. Колориметрические методы [80] Биуретовый метод [80] Метод Лоури [81] Определение белка в присутствии неионных детергентов [82] Определение с кумасси синим [83] 2. Спектрофотометрический метод [83] 3. Определение содержания белка в препаратах, иммобилизованных на сефарозе [84] Спектрофотометрическое определение в присутствии полиэтиленгликоля [84] Колориметрическое определение по модифицированному методу Брэдфорд [85] 4. Определение по азоту [85] Изотермическая перегонка аммиака (метод Конвея) [85] Микрометод определения азота в биологическом материале (по Енике) [87] II. Методы фракционирования белков [88] 1. Электрофоретическое разделение белков [88] Электрофорез на бумаге [89] Электрофорез в агаровом геле [92] Электрофорез в полиакриламидном геле [94] Аналитическое изоэлетрическое фокусирование белков в полиакриламидном геле [98] 2. Разделение белков методом хроматографии [101] Метод гель-хроматографии [106] Метод ионообменной хроматографии [108] Метод адсорбционной хроматография [114] III. Определение молекулярной массы белков [116] 1. Метод гель-хроматографии на колонках [116] 2. Гель-хроматография в тонком слое сефадекса [117] 3. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия [119] Метод Вебера и Осборн [119] Метод Лэммли [121] IV. Определение аминокислотного состава белков и пептидов [122] 1. Гидролиз белков и пептидов [123] Кислотный гидролиз [124] Щелочной гидролиз [125] 2. Разделение и идентификация аминокислот [125] Метод хроматографии на бумаге [126] Метод ионообменной хроматографии [132] Метод средневольтного горизонтального электрофореза на бумаге [137] V. Гидролиз белков до пептидов [139] 1. Ферментативный гидролиз [140] Расщепление трипсином [140] Расщепление химотрипсином [140] 2. Химический гидролиз [141 Расщепление по остаткам метионина [141] Расщепление по остаткам цистеина [142] Расщепление по остаткам триптофана [144] VI. Определение функциональных групп в белках и пептидах [145] 1. Свободные NН(?)-группы белков и пептидов [145] Определение N-концевых аминокислот методом динитрофенилирования [145] Определение количества свободных NН(?)-групп в пептидах (аминокислотах) методом частичного динитрофенилирования [147] Определение N-концевых аминокислот дансильным методом [148] 2. С-концевые аминокислоты в белках и пептидах [154] Определение С-концевых аминокислот с помощью карбоксипептидаз [155] Определение С-концевых аминокислот с помощью гидразинолиза [156] 3. Сульфгидрильные группы белков и пептидов [157] Определение числа сульфгидрильных групп методом титрования n-хлор-меркурибензоатом [158] Определение числа сульфгидрильных групп с помощью реактива Эллмана [160] Б. Нуклеиновые кислоты I. Количественное определение нуклеиновых кислот в биологическом материале [161] 1. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот [162] 2. Определение нуклеиновых кислот по фосфору [163] 3. Определение нуклеиновых кислот по пентозе [163] Определение содержания ДНК с дифениламином по Дише [163] Определение содержания РНК с орцином по Мейбаум [164] 4. Раздельное определение РНК и ДНК в тканях (по методу Шмидта—Таннгаузера) [164] II. Выделение нуклеиновых кислот [166] 1. Выделение и очистка ДНК по методу Мармура [166] 2. Выделение препаратов ДНК и РНК фенольным методом (по Кирби— Георгиеву) [167] 3. Выделение препарата РНК из печени крысы фенольным методом (по Шерреру) [169] 4. Выделение РНК из рибосом [170] III. Методы фракционирования нуклеиновых кислот [171] 1. Адсорбционная хроматография нуклеиновых кислот на гидроксилапатите [171] 2. Ультрацентрифугирование рибонуклеиновых кислот в градиенте плотности сахарозы [172] 3. Электрофорез рибонуклеиновых кислот в полиакриламидном геле [173] Разделение суммарной фракции РНК [173] Разделение рибосомальной РНК [174] IV. Ферментативное расщепление нуклеиновых кислот [175] 1. Получение рестриктов ДНК фага Я и разделение их с помощью электрофореза в геле агарозы [175] 2. Расщепление РНК панкреатической рибонуклеазой и разделение продуктов хроматографическими методами [176] Гель-хроматография на колонке с сефадексом [176] Ионообменная хроматография на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой [177] V. Определение нуклеотидного состава нуклеиновых кислот [177] 1. Нуклеотидный состав ДНК [177] Разделение оснований ДНК методом хроматографии на бумаге [178] Разделение оснований ДНК методом тонкослойной хроматографии [179] 2. Нуклеотидный состав РНК [180] Разделение рибомононуклеотидов методом электрофореза на бумаге [180] Разделение рибомононуклеотидов методом хроматографии на бумаге [181] Разделение рибомононуклеотидов методом тонкослойной хроматографии [182] В. Низкомолекулярные азотсодержащие соединения [183] I. Определение аденинсодержащих нуклеотидов в животных тканях [183] 1. Разделение адениловых нуклеотидов [183] Метод электрофореза на бумаге [183] Метод хроматографии на бумаге [184] Метод тонкослойной хроматографии [184] Метод ионообменной хроматографии на колонке [186] 2. Количественное определение компонентов адениловой системы [187] II. Определение содержания никотинамидных коферментов в животных тканях [187] 1. Определение НАД+ и НАДФ+ [188] 2. Определение НАДН и НАДФН [189] III. Определение креатина и фосфокреатина [188] 1. Определение креатина с диацетилом [189] 2. Определение фосфокреатина по фосфору [190] IV. Определение гистидинсодержащих дипептидов [191] 1. Определение карнозина в безбелковом экстракте по диазореакции [192] 2. Определение дипептидов с помощью хроматографии на бумаге [192] 3. Определение дипептидов с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках «Силуфол» [193] V. Определение свободных аминокислот [194] 1. Определение свободных аминокислот в мышечной ткани [195] 2. Определение свободных аминокислот в сыворотке крови [195] РАЗДЕЛ ТРЕТИЙ Энзимология (П. Л. Вульфсон, Н. К. Наградова, Г. А. Кочетов, В. И. Муронец) I. Общие принципы работы с ферментами [196] 1. Экстракция, методы очистки и определение чистоты ферментных препаратов [198] 2. Хранение ферментов [205] 3. Выражение активности ферментов [206] II. Исследование каталитических свойств ферментов [206] 1. Определение кинетических параметров [206] 2. Методы определения ферментативной активности [208] 3. Определение активности в системе сопряженных реакций [208] 4. Определение зависимости скорости реакции от концентрации субстрата [210] 5. Определение зависимости скорости реакции от рН [211] 6. Определение зависимости скорости реакции от температуры [211] 7. Исследование влияния ингибиторов [212] 8. Исследование стабильности ферментов [214] 9. Исследование аллостерических ферментов [214] III. Выделение, очистка и определение активности ферментов [216] 1. Гексокиназа [216] 2. Гликогенфосфорилаза [219] 3. Киназа фосфорилазы [222] 4. Получение фосфорилазы (?) [225] 5. Фосфоглюкомутаза [226] 6. Глюкозофосфатизомераза [232] 7. Фосфофруктокиназа [237] 8. Альдолаза [245] 9. Триозофосфатизомераза [249] 10. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа [253] 11. Получение триозофосфатов [258] 12. 3-Фосфоглицераткиназа [260] 13. Глицерол-3-фосфатдегидрогеназа [266] 14. Пируваткиназа [269] 15. Лактатдегидрогеназа [273] 16. Алкогольдегидрогеназа [276] 17. Транскетолаза [279] Транскетолаза из пекарских дрожжей [279] Транскетолаза из печени свиньи [285] 18. Получение фосфопентоз [287] 19. Получение ферментного препарата, содержащего триозофосфатизомеразу и глицерол-3-фосфатдегидрогеназу, из скелетных мышц кролика [290] 20. Креатинкиназа [291] IV. Иммобилизация ферментов на BrCN-сефарозе [296] 1. Получение препарата BrCN-активированной сефарозы [296] 2. Иммобилизация ферментов [297] 3. Определение активности иммобилизованных ферментов [298] 4. Получение иммобилизованных субъединиц олигомерных ферментов [300] 5. Иммобилизация фосфоглицераткиназы и ее использование для синтеза 1,3-дифосфоглицерата [303] 6. Получение иммуносорбентов и их использование для очистки антител [304] РАЗДЕЛ ЧЕТВЕРТЫЙ Иммуноферментный анализ (Т. В. Буларгина) I. Получение антител [307] 1. Получение поликлональных антител [307] 2. Получение моноклональных антител [309] II. Получение конъюгатов антител с ферментными метками [317] 1. Получение конъюгатов антител с пероксидазой [317] 2. Получение конъюгатов антител с щелочной фосфатазой [318] 3. Определение рабочего титра конъюгатов иммуноглобулинов с ферментной меткой [318] III. Изучение свойств антител [320] 1. Определение специфичности гибридом [320] 2. Определение титров антител в асцитных жидкостях [321] 3. Определение классов и подклассов иммуноглобулинов [321] 4. Определение эпитопной специфичности антител [322] 5. Определение аффинности антител [323] IV. Изучение антигенной структуры ферментов [325] 1. Очистка антигенов на иммуносорбенте с моноклональными антителами [325] 2. Сравнение антигенных структур изоферментов и ферментов из разных источников [325] РАЗДЕЛ ПЯТЫЙ Регуляция активности ферментов (Н. Ю. Гончарова, М. В. Иванов, Е. В. Петушкова, А. М. Рубцов) I. Регуляция активности ферментов клеточными метаболитами [330] 1. Изучение свойств цАМФ-зависимых протеинкиназ [330] 2. Регуляция активности пируваткиназы скелетных мышц [333] 3. Изучение изоферментного состава лактатдегидрогеназы сердечной и скелетной мышц [336] 4. Изучение информационных изменений лактатдегидрогеназы при связывании кофермента и субстрата [340] 5. Исследование внутриклеточной локализации изозимов аспартатами-нотрансферазы печени [351] 6. Аллостерическая регуляция активности фруктозо-1,б-дифосфатазы [354] II. Регуляция активности мембраносвязанных ферментов [358] 1. Исследование регуляторных свойств Са—АТФазы саркоплазматического ретикулума [358] 2. Изучение процессов активации аденилатциклазы [368] 3. Модуляция активности глюкозо-6-фосфатазы под действием детергентов [370] 4. Изменение свойств гексокиназы при связывании с мембранами [373] III. Роль белок-белковых взаимодействий в реализации каталитической активности ферментов [377] 1. Регуляция активности фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов [377] 2. Иммобилизация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [383] 3. Иммобилизация лактатдегидрогеназы [386] 4. Иммобилизация альдолазы и получение комплекса альдолазы с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой [389] IV. Подходы к выявлению функционально значимых участков и групп молекулы фермента [391] 1. Получение протеолитических фрагментов миозина, обладающих АТФазной активностью [391] 2. Роль сульфгидрильных групп и гидрофобных взаимодействий в АТФазной активности миозина [398] РАЗДЕЛ ШЕСТОЙ Метаболизм митохондрий. Биоэнергетика (А. Д. Виноградов, Ю. Н. Лейкин, Е. А. Васильева, В. Г. Гривенникова, А. Б. Котляр, Т. Ю. Липская) I. Получение интактных митохондрий из различных тканей [403] 1. Выделение митохондрий скелетных мышц [404] 2. Выделение митохондрий сердечной мышцы [405] 3. Выделение митохондрий печени крысы [406] II. Получение субмитохондриальных фрагментов и фракционирование митохондрий [407] 1. Получение субмитохондриальных фрагментов (препарат Кейлина—Хартри) [407] 2. Получение субмитохондриальных частиц из сердца быка [408] 3. Фракционирование интактных митохондрий печени крысы [410] III. Получение отдельных компонентов дыхательной цепи и реконструкция полиферментных систем [414] 1. Отделение к реконструкция компонентов дыхательной цепи (сукцинат-дегидрогеназа) [415] 2. Отделение к реконструкция компонентов дыхательной цепи (цитохром с) [418] 3. Отделение и реконструкция компонентов дыхательной цепи (на примере коэнзима Q) [421] 4. Получение сукцинат: убихинон-оксидоредуктазы (комплекс II) [423] 5. Получение сукцинат: цитохром с-оксидоредуктазы (комплекс II+III) [426] 6. Получение убихинон: цитохром с-оксидоредуктазы (комплекс III) [429] 7. Получение цитохромоксидазы (комплекс IV) [432] IV. Функционирование дыхательной цепи [435] 1. Дыхательная цепь. Ингибиторы переноса электронов [435] 2. Окисление НАДН в митохондриях различных тканей [436] 3. Функционирование первого пункта сопряжения в интактных митохондриях [438] 4. Ингибирование НАДН-оксидазной активности дыхательной цепи ротеноном [441] V. Проницаемость мембран и транслоказные реакции в митохондриях [442] 1. Перенос ионов калия через митохондриальную мембрану [442] 2. Изучение проницаемости митохондриальной мембраны для растворов электролитов [444] 3. Пассивная проницаемость внутренней мембраны митохондрий для анионов [447] 4. Активный транспорт ионов Са(?) в митохондриях печени [449] 5. Полярографическое изучение активного транспорта кальция в митохондриях печени [450] 6. Специфичность системы транспорта кальция в митохондриях [453] 7. Накопление ионов Mg(?) митохондриями сердечной мышцы [455] 8. Изучение кинетики транспорта неорганического фосфата в митохондриях [458] 9. Роль транслоказных реакций в кинетике синтеза и гидролиза АТФ в митохондриях [459] 10. Роль транслоказных реакций в функционировании ЦТК [460] VI. Реакции трансформации энергии в митохондриях [462] 1. Полярографическое определение степени сопряженности препарата митохондрий [462] 2. Измерение степени сопряженности и скорости окислительного фосфорилирования в митохондриях. Зависимость от концентрации белка и роль ионов Са(?) [465] 3. Окислительное фосфорилирование с различными субстратами [467] 4. Влияние разобщителей на процессы трансформации энергии в митохондриях [469] 5. Измерение АТФазной активности митохондрий [471] 6. Изучение АТФазной реакции, катализируемой АТФ-синтетазным комплексом митохондрий [474] 7. Влияние внутримитохондриального Са(?) на реакции синтеза и гидролиза АТФ в митохондриях [476] 8. Креатинкиназная активность митохондрий сердечной мышцы [479] VII. Некоторые методы, применяемые при изучении метаболизма митохондрий [480] 1. Полярографический метод определения поглощения кислорода [480] 2. Определение белка митохондрий и субмитохондриальных частиц с биуретовым реактивом [483] 3. Определение концентрации растворов магния и кальция методом комплексонометрического титрования [484] Приложение [487] |
Формат: | djvu |
Размер: | 5372428 байт |
Язык: | RUS |
Рейтинг: | 242 |
Открыть: | Ссылка (RU) |